一般酶标仪的测定波长在400～750nm或800nm之间，可以满足ELISA的显色测定。ELISA试剂盒所使用的标记用酶均为辣根过氧化物酶(HRP)，底物通常为四甲基联苯胺(TMB)和邻苯二胺(OPD)，其在过氧化氢溶液的存在下，经HRP作用，分别氧化为2，2，—二氨基偶氮苯(DAB)和联苯醌。当pH值为5.0左右时，DAB在450nm波长处有最大吸收，当pH值降为L0时，最大吸收波长移至492nm，同时摩尔消光系数变大，显色加深，因而常用强酸如硫酸或盐酸终止反应。TMB的氧化产物联苯醌在波长450nm处有最大消光系数，如果HRP量少，H：O：和TMB过量时，则形成蓝色的阳离子根。降低pH，即可使蓝色的阳离子根转变为黄色的联苯醌，使用硫酸作为终止剂可使产物稳定90min。因此，450nm和492 nm两个波长是目前ELISA测定常用的。各种酶标仪都配有放置滤光片的可自动转换的部件，可以同时安装6～8片滤光片，所配备的滤光片均应包括上述两个波长，有的酶标仪以490nm滤光片替代492nm滤光片，影响不大。
除了这两个基本滤光片外，考虑到双波长比色的需要，还应有620nm或630nm或650nm和405nm波长的滤光片，其他滤光片可根据自己的需要选择。有时，有的实验室希望用酶标仪作微量生化测定，故酶标仪生产厂家对其生产的酶标仪扩展了紫外检测功能，此时需要一个340nm波长滤光片。此时，酶标仪的测定波长范围就成为340—750nm或800nm。
酶标仪有单波长和双波长检测功能。有时使用者不知在什么情况下使用单或双波长检测。所谓的“单波长”就是使用一种对显色具最大吸收的波长即450nm或492nm进行比色测定；而“双波长”则除了用对显色具最大吸收的波长即450nm或492nm进行比色测定外，同时用对特异显色不敏感的波长如630nm进行测定，酶标仪最后打印出来的吸光度则为二者之差。630nm波长下得到的吸光度是非特异的，来自于板孔上诸如指纹、灰尘、脏物等所致的吸收。因此，在ELISA比色测定中，最好使用双波长，且不必设空白孔。
